李朝阳 近红外光激发氧化石墨烯/磷酸银/壳聚糖涂层改善钛表面抗菌性能的研究

  综上述，本研究中Ti-GO/Ag3PO4/CS涂层具备优秀能力的抗菌性能，适用于医用植入物表面抗菌改性。

  王轶凡1，许英德1，张雪枫1，刘菁宇1，韩金彤1，朱胜利1，梁砚琴1，吴水林1，崔振铎1，吕维加2，李朝阳1

  1. 天津市复合与功能材料重点实验室 天津大学材料科学与工程学院（天津 300350）

  基金项目：国家自然科学基金资助项目（51871163）；天津市自然科学基金资助项目（20JCZDJC00580）

  设计并构建一种氧化石墨烯（graphene oxide，GO）/磷酸银（Ag3PO4）/壳聚糖（chitosan，CS）复合涂层，用于植入物手术中快速杀灭细菌，预防术后感染。

  使用离子交换法制备GO/Ag3PO4复合材料，并在生物钛（Ti）片上依次沉积CS和GO/Ag3PO4复合材料，制备Ti-GO/Ag3PO4/CS材料。对材料的形貌、物相、光热和光催化性能、抗菌能力及与基体的结合力进行表征。

  使用离子交换法成功制备GO/Ag3PO4复合材料，通过形貌物相测试证明了GO/Ag3PO4的异质结构，Ag3PO4和GO形成的异质结构使带隙从1.79 eV 降低到1.39 eV，可以被808 nm近红外光激发。光热、光催化实验表明GO/Ag3PO4/CS复合涂层拥有非常良好的光热和光动力性能；体外抗菌实验表明，GO/Ag3PO4CS复合涂层在808 nm近红外光照射20 min后对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到99.81%；同时该复合涂层拥有非常良好的光稳定性，能够给大家提供稳定和持续的抗菌效果。

  GO/Ag3PO4/CS复合涂层可以被808 nm近红外光激发产生活性氧，在光照下具备优秀能力的抗菌能力。

  开放性手术引起的切口感染严重降低了人工骨植入手术成功率，植入体内的骨植入物表面会因为蛋白凝聚等原因附着大量细菌[1]。据报道，骨科手术后引发的植入物感染发生率达5%[2]。目前针对体内细菌感染采取的主要治疗方式依旧是口服和注射抗生素，而预防性使用抗生素无法靶向清除材料表面细菌，同时抗生素滥用导致了严重的抗生素耐药性问题和超级细菌的出现[3]。2021年世界卫生组织（WHO）透露目前处于研发中的43种抗生素均没有办法解决细菌耐药性问题。植入物表面涂层既可以保留材料基本特性，又可使抗菌材料直接作用于病灶部位[4]，提升了植入物表面抗细菌黏附和抗菌能力，有利于预防和治疗植入物感染[5]。

  近年来，光热疗法和光动力疗法因其抑制细菌生长的作用获得广泛研究[6]，但仍未出现能够完美解决植入物表面抗菌问题的涂层材料。光热和光动力材料分别通过光激发产生的局部热和活性氧（reactive oxygen species，ROS）来破坏细菌膜结构和蛋白质[7]。相对于可见光激发源，808 nm近红外光具有优秀的穿透效果，更容易穿透人体组织和血液，且更容易聚焦到患处[8]。同时由于光疗依赖光源提供能量进行抗菌，在无光条件下涂层不会对身体组织产生危害。因此，利用表面涂层增强材料表面抗菌能力可行且具有应用价值。

  壳聚糖（chitosan，CS）具有优秀的成膜性及抗菌效果，其表面富有丰富的阳离子基团，覆盖了CS的钛片与负电性氧化石墨烯（graphene oxide，GO）可以产生静电吸附作用，增强涂层结合力[9-10]。GO比表面积大，表面富含各种官能团，金属纳米颗粒更容易均匀分散在其表面，由此减少纳米颗粒团聚，是纳米复合材料的优良载体[11-13]；同时，GO还具有优秀的光热性能，能吸收光能产生局部热，利用GO抗菌性能的研究已成为热点[14-16]。磷酸银（Ag3PO4）具有优秀的光催化能力，微溶于水的特点使其可在水中缓慢溶解释放Ag+，实现长期抑菌作用[17-19]。然而Ag3PO4 2.52 eV的过大带隙导致其无法被808 nm近红外光激发产生ROS[20]。鉴于此，本研究拟利用GO作为载体装载Ag3PO4并调整其带隙，形成GO/Ag3PO4异质结构用于光热-光动力协同抗菌，并利用CS增强材料与基体的结合力，以期为预防钛植入物感染提供解决策略。

  GO粉末（南京先丰纳米材料科技有限公司）；AgNO3（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CS（上海源叶生物科技有限公司；生物试剂，脱乙酰度90%）；生物钛片（直径6 mm、高2.5 mm；上海宝山钢铁股份有限公司）；化学品均为分析级，无需进一步纯化即可使用。

  细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）；Cu Kα辐射X射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD；Bruker公司，德国）；S-4800扫描电镜（Hitachi公司，日本）；JEM2100F透射电镜（JEOL公司，日本）；FLIR热照相机（FLIR公司，美国）；UV-2700型紫外-可见光分光光度计（岛津公司，日本）；带有标准三电极系统的电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；酶标仪（Biotek公司，美国）。

  然后，取50 mg CS溶解于装有10 mL去离子水的烧杯中，加入200 μL冰醋酸搅拌至完全溶解；将生物钛片于CS溶液中浸泡30 min后，在60℃烘箱中烘干，得到材料Ti-CS。在Ti-CS上滴加20 μL GO/Ag3PO4溶液并于37℃烘箱中烘干，重复4次，得到材料Ti-GO/Ag3PO4/CS。以同样方式滴加相同浓度GO溶液，得到材料Ti-GO/CS。

  取材料Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS，采用Cu Kα辐射XRD进行物相表征，采用扫描电镜和透射电镜进行微观结构和形貌分析。

  用近红外光（808 nm，0.5 W/cm2）对材料Ti、Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS照射5 min，通过FLIR热照相机记录材料每分钟的温度和热图像，测量材料升温曲线光腐蚀是影响Ti-GO/Ag3PO4/CS涂层光稳定性的重要的因素，因此对Ti-GO/Ag3PO4/CS涂层进行3次光热循环测试，即使用近红外光照射材料5 min，然后冷却5 min，连续测试3个循环，以10 s间隔记录材料的加热-冷却曲线材料的光催化性能检测

  用UV-2700型紫外-可见分光光度计测量Ti、Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS的光吸收能力；并使用Tauc Plot法计算材料带隙，计算公式：αhv=A（hv−Eg）n/2。其中α表示吸收系数，h表示普朗克常量，v表示光频率，A表示比例常数，Eg表示带隙，n和半导体材料的类型有关（直接带隙半导体n=1，间接带隙半导体n=4）。

  利用DCFH-DA测量材料ROS总释放量。首先，将以乙醇为溶剂的0.5 mL 1 mmol/L DCFH-DA溶液与2 mL 10 mmol/L NaOH溶液在黑暗中混合并搅拌30 min；之后用PBS（pH=7.4）稀释溶液，−20℃下避光保存备用。黑暗中在放入各测试材料的96孔板中加入0.1 mL稀释的DCFH-DA溶液，然后用近红外光（808 nm，0.5 W/cm2）照射该孔；将0.1 mL溶液全部转移至另一96孔板中，通过酶标仪测量溶液在525 nm波长处吸光度（A）值，以5 min为间隔测量20 min，ROS总释放量由各材料的A值得出。

  通过涂布平板法研究各材料对金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）的抗菌活性。细菌于37℃下在普通培养基（含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、15 g/mL琼脂）中培养，然后稀释至1×107 CFU/mL用于后续实验。取稀释后的10 μL细菌悬液滴加在各材料上，模拟细菌在植入物表面附着。材料通过光照产生ROS和局部热进行杀菌，因此分为光照组和黑暗组。黑暗组涂层在黑暗中放置20 min，光照组涂层采用808 nm近红外光照射20 min。然后，将处理后的材料放入有1 mL普通培养基的离心管中稀释并震荡，将黏附于材料上的细菌剥离；然后将稀释后的20 μL细菌溶液均匀涂抹在LB琼脂平板上，于37℃恒温培养箱中培养24 h，观察各材料黑暗和光照下的抑菌情况。以未接触材料而直接稀释至相同浓度的细菌作为对照。按以下公式计算抗菌效率：抗菌效率=（CFU对照−CFU材料）/ CFU对照×100%。

  将Ti-GO/Ag3PO4/CS置于含2 mL PBS溶液的离心管中，放在摇床中震荡以模拟身体运动，摇床转速120 r/min，12 h后取出材料在烘箱中烘干。浸泡前后分别行大体观察和扫描电镜观察。

  采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计分析。计量资料行正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验；检验水准α=0.05。

  GO/Ag3PO4透射电镜观察示，GO为层片状结构，粒径为5～50 nm的Ag3PO4颗粒紧密贴合在GO层片状结构上；GO/Ag3PO4高分辨率透射电镜观察示，Ag3PO4的晶格条纹在图中被放大并作出标记，其中0.303 nm和0.190 nm晶格间距分别对应Ag3PO4的（200）和（310）晶格平面。见图1a～c。

  Ti-GO/Ag3PO4/CS涂层的XRD图谱中发现立方晶系Ag3PO4的主峰（210）晶面峰及（231）晶面峰[21]；由于Ag3PO4的紧密结合破坏了GO的晶面结构，导致Ti-GO/CS涂层中未出现GO（001）晶面峰。见图1g、h。

  各材料升温曲线℃左右，提示Ag3PO4增强了GO的光热效应。光热循环测试示，Ti-GO/Ag3PO4/CS涂层在3个周期的最高气温变化可以忽略不计，最高温度稳定在60℃左右，说明材料的光耐热性良好。见图2。

  紫外-可见光谱对不一样的材料的光学性质评价示，纯Ti与Ti-CS在300～850 nm波长未展现出光吸收能力；Ti-GO/CS具有相对良好的光吸收能力，并在波长500 nm处达峰值；而引入Ag3PO4的复合涂层不仅提高了材料的光吸收能力，还引起了光吸收峰值红移（移动至600 nm附近）。见图3a。

  光电流响应测试示，Ti-GO/Ag3PO4/CS相对于其他材料展现出最高的光电流响应，说明Ti-GO/Ag3PO4/CS在受到808 nm近红外光激发时电荷分离速度最快，跃迁电子数量最多。电化学阻抗谱测试中，较低阻抗可以证明材料的电子转移效率相对更高，而更高的电子转移效率使电子与水分子反应更快，ROS的产率更高。光照组Ti-GO/Ag3PO4/CS的阻抗较黑暗组更低，因此Ti-GO/Ag3PO4/CS电子转移效率最高，光催化效果最好。见图3c、d。纯Ti和Ti-CS在808 nm近红外光照射下不会产生ROS，Ti-GO/CS在光照后会产生少量ROS，而Ti-GO/Ag3PO4/CS的ROS总释放量明显高于其他材料，差异有统计学意义（P0.05）。见图3e。

  Ti-GO/Ag3PO4/CS经12 h浸泡、震摇前后无明显差异，浸泡后材料颜色略有不均匀，可能是因浸泡后Ag3PO4团聚所致。浸泡12 h后扫描电镜观察示，材料中Ag3PO4团聚成直径2～10 μm的颗粒，但未消失，说明GO抑制了Ag3PO4的溶解，提示Ti-GO/Ag3PO4/CS与基体结合稳定。见图5。

  在既往几十年中，医学界一直在努力开发新的抗生素，以治疗对传统抗生素产生耐药性的细菌，如青蒿素、万古霉素和达拉菲等[22]。抗生素的研发周期和成本相当高，但是细菌产生耐药性却只需要1周甚至更短时间。使用抗生素预防和治疗感染的缺点及副作用也是不容忽视的。例如，抗生素引发的过敏反应普遍且危险；单一的抗生素仅能消灭1种或几种细菌，而抗生素联用后产生的不良反应亦会显著增多；抗生素对患者肝肾功能负担很大，尤其是老人和儿童；抗生素抗菌极易产生耐药菌；抗生素通过注射或口服方式摄入，无法靶向清除患处感染。因此，探索更多更优秀的抗菌手段，在未来人类与细菌的战斗中特别的重要[23]。金黄色葡萄球菌是植入物细菌感染的常见病原体，通常用平板涂布法测试涂层对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。其中菌落数量代表了材料抗菌能力。除了利用抗生素治疗和预防细菌感染外，许多新兴抗菌策略也非常关注并得到普遍研究。改性抗菌肽是天然存在于人类和动物体内的一类抗菌物质，具有广谱抗菌活性，可对抗许多细菌、线]。季铵盐是一种拥有非常良好抗菌性能的双亲物质，其长链烷基部分是一种疏水性（非极性）部分，可以穿透非极性细胞膜，改变细胞膜的通透性来杀灭细菌。但他们分别作为酶和有机盐，具有严重的生物毒性，限制了其应用空间。因此，特别难找到一种可杀灭细菌却对自身细胞无影响的抗菌方式。光热-光动力抗菌材料通过产生的局部热和ROS破坏细菌的膜和蛋白质，可实现广谱抗菌[25]；同时，由于光疗材料的光响应和ROS快速产生，能轻松实现患处有明确的目的性地快速杀菌[26]，并可在黑暗环境下利用涂层优秀的生物相容性对机体提供所需的成骨活性。Ag3PO4的应用场景范围十分普遍，除了应用于医疗设施和医用材料外，其还被用于口腔卫生、皮肤科、儿科等医疗领域。Ag3PO4具有优秀的光催化能力，可通过光生电子将H2O和O2等转化为ROS。但其过宽的带隙限制了其在体内的应用。将Ag3PO4负载至其他半导体或二维材料上，可以明显提高其光稳定性[27]。同时，选择正真适合的半导体材料更有助于降低其复合材料的带隙，使其能够接收更长的波长光进行原位抑菌[28]。GO拥有良好的光热性能和光催化效果，原因是缺陷位点能够给大家提供更多的活性催化中心[29-30]。同时，GO的二维结构为纳米粒子的附着和均匀分布提供了更多位点，也对细菌表面具有物理刺破的作用。但Ag3PO4和GO的带隙太宽，均不能被808 nm近红外光激发，而制备的GO/Ag3PO4是一种异质结构，可以大大降低材料的带隙，降低了被近红外光激发所需的能量，使得光生电子能够从GO转移到Ag3PO4，最终移动到表面[31]。同时，掺杂Ag3PO4阻碍了光生电子与空穴的结合，增加了光生电子浓度；Ag3PO4的引入也扩大了涂层的比表面积，提供了更多活性位点，光生电子更容易与Ag3PO4表面的O2和H2O反应生成ROS，这样使Ti-GO/Ag3PO4/CS比Ti-GO/CS更容易产生ROS，快速杀菌。GO/Ag3PO4受808 nm近红外光照射产生ROS的机制见图6。